本发明公开了一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及方法。本发明利用45°微棱镜，将通常物镜复杂倾斜放置的光片系统简化为透射式显微成像系统，光路调节简单，能够与多种成像模态相结合；且样品只需注射入微管，或使细胞等生物样品在微管中生长即可，无需对样品进行复杂的处理；且一次即可激发完整的轴平面，能快速实现轴向特殊分布样品的观测，且装置可以在一定程度上完成对大数值孔径物镜的使用，从而改善传统光片荧光显微成像中分辨率无法逐步提升的限制；并且，光路设计简单易行，便于实现后续产业化发展。
(19)国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 CN 113552709 B (45)授权公告日 2022.05.20 (21)申请号 8.3 G01N 21/64 (2006.01) (22)申请日 2021.07.20 (56)对比文件 (65)同一申请的已公布的文献号 CN 109804293 A,2019.05.24 申请公布号 CN 113552709 A CN 107966799 A,2018.04.27 CN 105182523 A,2015.12.23 (43)申请公布日 2021.10.26 CN 111307772 A,2020.06.19 (73)专利权人 北京大学 US 2020371032 A1,2020.11.26 地址 100871 北京市海淀区颐和园路5号 李焱，龚旗煌.从光学显微镜到光学“显纳 镜”《物理与工程》.2015,第25卷(第2期),. (72)发明人 施可彬王玥董大山龚旗煌 陈炫亦,李绍军,陈卫民,孟泉科.光片荧光 杨宏 显微镜特点及其应用.《生物技术进展》.2021,第 (74)专利代理机构 北京万象新悦知识产权代理 11卷(第2期), 有限公司 11360 审查员 胡文波 专利代理师 王岩 (51)Int.Cl. G02B 21/00 (2006.01) G02B 21/02 (2006.01) 权利要求书4页 说明书8页 附图3页 (54)发明名称 基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成 像装置及方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于微棱镜的反射式轴 向光片荧光显微成像装置及方法。本发明利用 45°微棱镜，将通常物镜复杂倾斜放置的光片系 统简化为透射式显微成像系统，光路调节简单， 能够与多种成像模态相结合；且样品只需注射入 微管，或使细胞等生物样品在微管中生长即可， 无需对样品进行复杂的处理；且一次即可激发完 整的轴平面，能快速实现轴向特殊分布样品的 观测，且装置可以在一定程度上完成对大数值孔径物镜的使 用，从而改善传统光片荧光显微成像中分辨率无 法逐步提升的限制；并且，光路设计简单易行， B 便于实现后续产业化发展。 9 0 7 2 5 5 3 1 1 N C CN 113552709 B 权利要求书 1/4页 1.一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征是，所述基于微棱 镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置包含：激光光源、高斯光扩束准直装置、空间光场调 控装置、聚焦透镜、数字扫描装置、4f中继系统、激发物镜、接收物镜、平移台、第一管镜、第 一相机、样品架、压电扫描系统、白光照明系统和控制装置；其中，样品架包括平板、通光孔、 微棱镜固定装置、微管固定装置、微管和45°微棱镜，平板的中间开设有贯穿平板上下表面 的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置有微棱镜固定装置，在微棱镜固定装 置的两侧分别设置有微管固定装置，通光孔的底部为竖直放置的激发物镜，微管通过微管 固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45°微棱镜通过微棱镜固定装置 安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面为反射面，45°微棱镜的第一直角边面位于x‑y 平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微 管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与 微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的截面为圆形，则45°微棱镜的第一直角边面 的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面；在45°微棱镜的反射面的上方为竖直放置的 接收物镜，样品位于微管内；样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统 上；接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控制装置； 激光光源发射出线偏振高斯光束；线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光 场调控装置；空间光场调控装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正 以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描 装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通 过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到 竖直放置的激发物镜后焦平面作为激发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向；聚焦透镜、4f 中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通过聚焦透镜和4f中继系 统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光束扫描系统，使轴向 线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚焦，激发物镜的后焦平面 与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后焦平面处的频谱分布由激 发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光束的y‑z平面的光片，形成 虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，对位于微管内的样品进 行片状激发，产生荧光；荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射成x‑y平面，直接由竖直放置 的接收物镜收集；经第一管镜会聚成像到第一相机上；第一相机直接接收样品的二维图像； 同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中样品位于激 发物镜的前焦平面；控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步；压电扫描系统对样品进 行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整个三维荧光分布，从而 得到样品的三维分布； 所述空间光场调控装置包含二分之一波片、96°棱镜和空间光调制器；其中，二分之一 波片对扩束准直后的线偏振高斯光束进行偏振态调制，使其与空间光调制器的硅基液晶晶 体偏振方向相适配；96°棱镜对光路进行折叠，偏振态呈水平偏振的线°反射棱 镜反射后投射到空间光调制器的硅基液晶面板上，通过空间光调制器上加载不同的相位全 息图，产生无衍射光束，无衍射光束为贝塞尔光束或者艾利光束，调制后的光场再次被96° 反射棱镜反射至光路中，入射角与反射角之间的夹角为6°，使得达到空间光调制器最高的 2 2 CN 113552709 B 权利要求书 2/4页 调制效率。 2.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征是， 所述高斯光扩束准直装置包含焦距不同的两个透镜，其中，焦距不同的两个透镜对激光器 出射的线偏振高斯光束的准直状态和光斑直径进行调制，从而出射准直光，且光斑的直径 与空间光调制器的液晶面板相适配。 3.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征是， 所述数字扫描装置为一维扫描振镜，经过控制装置控制一维扫描振镜的扫描范围、步进距 离和采样点数实现对光束的快速扫描，使聚焦到样品的无衍射光束形成光片。 4.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征是， 所述4f中继系统包括焦距相同的两个透镜，将数字扫描装置所在平面与激发物镜后焦平面 的光场分布完全一致。 5.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征是， 所述白光照明系统包括LED白光光源、第二管镜和第二相机，其中，LED白光光源照射样品， 由激发物镜收集后，经第二管镜成像到第二相机上，观察样品的x‑y平面信息，并确定微管 中的样品处于激发物镜的前焦平面，即处于贝塞尔光束区。 6.如权利要求1所述的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置，其特征是， 所述控制装置为数字采集系统DAQ，通过输出模拟信号控制数字扫描装置的扫描范围和采 样频率；通过输出数字信号触发控制第一相机逐行曝光、曝光每行之间的间隔和触发延时； 模拟信号和数字信号同步输出，通过设置每个平面的曝光时间、步进距离和扫描范围，保证 数字扫描装置的每一个扫描位置与第一相机曝光行相匹配，以保证高分辨成像。 7.一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像方法，其特征是，所述成像方法 包括以下步骤： 1)装置安装： a)将平板的中间开设贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上 方设置微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置微管固定装置，通光孔的底部 设置竖直放置的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔 的顶部，45°微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面为反 射面，45°微棱镜的第一直角边面位于x‑y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平 齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩 形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的 截面为圆形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面，在 45°微棱镜的反射面的上方为竖直放置的接收物镜，接收物镜放置在平移台上，完成样品架 设置； b)将样品位于微管内，样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统 上； c)接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控制装 置； 2)激光光源发射出线)线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场调控 3 3 CN 113552709 B 权利要求书 3/4页 装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分 布特性进行改变； 4)经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用 在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后 由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作为激 发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向； 5)聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通过聚 焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光，由光 束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚焦，激 发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后焦平面 处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光束的y‑ z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表面，对位 于微管内的样品进行片状激发，产生荧光； 6)荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射成x‑y平面，直接由竖直放置的接收物镜收 集：调节接收物镜的位置，使接收物镜的中心与45°微棱镜的反射面相对应，样品架设置在 压电扫描系统的压电平移台上，压电平移台所在平面为x‑y平面，垂直于压电平移台的方向 为z方向，微管的长边方向为y方向，短边方向为x方向，具体调节方法如下： i.样品架位于压电扫描系统的压电平移台上，观测微管的位置，通过压电平移台移动 微管的位置，使得微管大致位于激发物镜的中心，在微管中放置荧光微球，打开白光照明系 统，调节样品架的z方向，在相机中观察到样品架，调节样品架的x方向位置，直至在第二相 机中观察到微管中的样品处于在焦状态，继续调节样品架的x方向位置，能够观察到45°微 棱镜、样品和微管的管壁，并在保持y方向不动的前提下，将样品架移动到样品位于前焦平 面的位置； ii.45°微棱镜和微管的管壁之间的距离在0.1mm～0.5mm，在调节探测物镜时，只小范 围微调接收物镜的x方向距离，经过45°微棱镜反射的光的光程大于微管直接透射光的光 程，在实际调节时，通过确定45°微棱镜的反射面为焦平面，横向移动探测物镜，不再进行探 测物镜轴向位置调节时，均不存在焦图像，且能够在视野中观察到微管的管壁的信息来判 断第一相机的探测平面是否为45°微棱镜反射的样品的轴平面信息； 7)经第一管镜会聚成像到第一相机上； 8)第一相机直接接收样品的二维图像； 9)同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中样品 位于激发物镜的前焦平面； 10)控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步； 11)压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫 描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。 8.如权利要求7所述的成像方法，其特征在于，在步骤9)中，控制装置为数字采集系统 DAQ，通过输出模拟信号控制数字扫描装置的扫描范围和采样频率；通过输出数字信号触发 控制第一相机逐行曝光、曝光每行之间的间隔和触发延时；模拟信号和数字信号同步输出， 通过设置每个平面的曝光时间、步进距离和扫描范围，保证数字扫描装置的每一个扫描位 4 4 CN 113552709 B 权利要求书 4/4页 置与第一相机曝光行相匹配，以保证高分辨成像。 5 5 CN 113552709 B 说明书 1/8页 基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置及方法 技术领域 [0001] 本发明涉及光片荧光显微成像技术，具体涉及一种基于微棱镜的反射式轴向光片 荧光显微成像装置及其成像方法。 背景技术 [0002] 光学显微成像技术凭借其非接触、低损伤的特点在活体生物研究中具有重要应 用。利用荧光染料或基因工程可以对细胞内的各类分子和细胞器进行特异性标记，荧光显 微成像技术可以还原细胞内荧光标记的精细结构，并对单个分子或细胞器进行追踪与检 测，进而实现对生命本质的探索与调控。但传统荧光显微镜拍摄到的图像无法将离焦荧光 基团发射的荧光信号屏蔽，导致其存在非常高的背景噪声。若对整个样品进行三维成像，荧 光基团不得不被多次激发，导致严重的光漂白和光毒性。而一次选择性激发一个平面的光 片荧光显微成像技术可以很好地解决这个问题。 [0003] 相对于传统荧光显微镜，光片荧光显微技术选用选择性的片状激发方式，对样品 进行一次一个平面激发，该平面外其余区域不激发，显著地减少了无效曝光，从而有效地降 低了光漂白和光损伤。与此同时，该激发平面同时位于探测物镜的焦平面，探测物镜与激发 物镜正交放置，因此，相对于传统荧光显微镜点扫描的成像方式，光片荧光显微技术的宽场 成像方式大大提高了系统的成像速度。 [0004] 光片荧光显微技术自提出以来得到了飞速发展，然而由于其本身激发光片位于探 测物镜焦平面的特性，大多采用两个倾斜物镜正交放置分别进行样品的激发与荧光信息的 收集。而通常使用物镜为高数值孔径物镜，工作距离有限，致使光路调节非常复杂。且光路 的复杂性会降低其与其它模态同时成像的适用性，限制了光片显微成像技术的进一步发 展。单物镜成像光片成像技术被提出，但该技术对光的利用率较低，且光路调节十分复杂。 发明内容 [0005] 为了解决上述提到的光片荧光显微成像的局限问题，本发明提供一种基于微棱镜 的反射式轴向光片荧光显微成像装置及其成像方法，通过对样品槽进行特殊设计，常规的 透射式显微成像光路即可实现光片成像，光路简单，且能够与多种成像模式相结合，进一步 拓展了光片显微成像技术的应用范围。 [0006] 本发明的一个目的在于提出一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装 置。 [0007] 本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置包括：激光光源、高斯 光扩束准直装置、空间光场调控装置、聚焦透镜、数字扫描装置、4f中继系统、激发物镜、接 收物镜、平移台、第一管镜、第一相机、样品架、压电扫描系统、白光照明系统和控制装置；其 中，样品架包括平板、通光孔、微棱镜固定装置、微管固定装置、微管和45°微棱镜，平板的中 间开设有贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置有微棱镜 固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置有微管固定装置，通光孔的底部为竖直放置 6 6 CN 113552709 B 说明书 2/8页 的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45°微 棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面为反射面，45°微棱 镜的第一直角边面位于x‑y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边 面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面为矩形，则45°微棱 镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微管的截面为圆形， 则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平面；在45°微棱镜的 反射面的上方为竖直放置的接收物镜，样品位于微管内；样品位于激发物镜的前焦平面处， 样品架放置在压电扫描系统上；接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和 第一相机连接至控制装置；激光光源发射出线偏振高斯光束；线偏振高斯光束经高斯光扩 束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场调控装置产生无衍射光束，并且对产生的 无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；经过聚焦透镜，无 衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换作用在数字扫描装置处产生无 衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光片，后由4f中继系统将数字扫描 装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作为激发光，进入激发物镜入瞳， 光轴沿z方向；聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束 通过聚焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线 光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜 聚焦，激发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的 后焦平面处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射 光束的y‑z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表 面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光；荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射 成x‑y平面，直接由竖直放置的接收物镜收集；经第一管镜会聚成像到第一相机上；第一相 机直接接收样品的二维图像；同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处 信息，确定微管中样品位于激发物镜的前焦平面；控制装置控制数字扫描装置和第一相机 同步；压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描， 获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。 [0008] 高斯光扩束准直装置包括焦距不同的两个透镜，其中，焦距不同的两个透镜对激 光器出射的线偏振高斯光束的准直状态和光斑直径进行调制，从而出射准直光，且光斑的 直径与空间光调制器的液晶面板相适配。 [0009] 空间光场调控装置包括二分之一波片、96°棱镜和空间光调制器；其中，二分之一 波片对扩束准直后的线偏振高斯光束进行偏振态调制，使其与空间光调制器的硅基液晶晶 体偏振方向相适配；96°棱镜对光路进行折叠，偏振态呈水平偏振的线°反射棱 镜反射后投射到空间光调制器的硅基液晶面板上，通过空间光调制器上加载不同的相位全 息图，产生无衍射光束，无衍射光束为贝塞尔(Bessel)光束或者艾利(Airy)光束，调制后的 光场再次被96°反射棱镜反射至光路中，入射角与反射角之间的夹角为6°，使得达到空间光 调制器最高的调制效率。空间光调制器为纯相位型硅基液晶空间光调制器，液晶分子为平 行排列的向列型液晶分子，整体呈现单轴晶体性质。液晶空间光调制器通过调制每一个像 元中液晶分子的主轴方向实现像素化的折射率变化的均匀厚度液晶面板。因此，空间光调 制器对入射光的偏振态要求很高。且进行全息图加载前，需确定电压占空比与相位调制值 7 7 CN 113552709 B 说明书 3/8页 之间的关系，即伽马校正。通过对入射光场加载合适的相位全息图，进而得到所期望的出射 光场分布。通过盖师贝格‑撒克斯通(Gerchberg–Saxton,GS)GS算法完成对拟产生的光场额 相位全息图计算，将相位全息图加载到空间光调制器上即产生所期望的光场分布。 [0010] 数字扫描装置为一维扫描振镜，通过控制装置控制一维扫描振镜的扫描范围、步 进距离和采样点数实现对光束的快速扫描，使聚焦到样品的无衍射光束形成光片。 [0011] 4f中继系统包括焦距相同的两个透镜，将数字扫描装置所在平面与激发物镜后焦 平面的光场分布完全一致。 [0012] 白光照明系统包括LED白光光源、第二管镜和第二相机，其中，LED白光光源照射样 品，由激发物镜收集后，经第二管镜成像到第二相机上，观察样品的x‑y平面信息，并确定微 管中的样品处于激发物镜的前焦平面，即处于贝塞尔光束区。 [0013] 控制装置为数字采集系统DAQ，通过输出模拟信号控制数字扫描装置的扫描范围 和采样频率；通过输出数字信号触发控制第一相机逐行曝光、曝光每行之间的间隔和触发 延时；模拟信号和数字信号同步输出，通过设置每个平面的曝光时间、步进距离和扫描范 围，保证数字扫描装置的每一个扫描位置与第一相机曝光行相匹配，以保证高分辨成像。 [0014] 本发明的另一个目的在于提出一种基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像 方法。 [0015] 本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像方法，包括以下步骤： [0016] 1)装置安装： [0017] a)将平板的中间开设贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔 的上方设置微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置微管固定装置，通光孔的 底端设置竖直放置的激发物镜，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通 光孔的顶部，45°微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面 为反射面，45°微棱镜的第一直角边面位于x‑y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表 面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的截面的形状为矩形或圆形，微管的截面 为矩形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，或者微 管的截面为圆形，则45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧壁最外侧切面在同一平 面，在45° [0018] 微棱镜的反射面的上方为竖直放置的接收物镜，接收物镜放置在平移台上，完成 样品架设置； [0019] b)将样品位于微管内，样品位于激发物镜的前焦平面处，样品架放置在压电扫描 系统上； [0020] c)接收物镜放置在平移台上，压电扫描系统、数字扫描装置和第一相机连接至控 制装置； [0021] 2)激光光源发射出线)线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置后，进入空间光场调控装置；空间光场 调控装置产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空 间分布特性进行改变； [0023] 4)经过聚焦透镜，无衍射光束聚焦至数字扫描装置，并因聚焦透镜的傅里叶变换 作用在数字扫描装置处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的光 8 8 CN 113552709 B 说明书 4/8页 片，后由4f中继系统将数字扫描装置上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜后焦平面作 为激发光，进入激发物镜入瞳，光轴沿z方向； [0024] 5)聚焦透镜、4f中继系统和激发物镜满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光束通 过聚焦透镜和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线光， 由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜聚 焦，激发物镜的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物镜的后 焦平面处的频谱分布由激发物镜的傅里叶变换作用，在激发物镜的前焦平面产生无衍射光 束的y‑z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂直于样品表 面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光； [0025] 6)荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射成x‑y平面，直接由竖直放置的接收物镜 收集； [0026] 7)经第一管镜会聚成像到第一相机上； [0027] 8)第一相机直接接收样品的二维图像； [0028] 9)同时白光照明系统发出白光照射至样品的表面，观测样品处信息，确定微管中 样品位于激发物镜的前焦平面； [0029] 10)控制装置控制数字扫描装置和第一相机同步； [0030] 11)压电扫描系统对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动 扫描， [0031] 获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。 [0032] 在步骤6)中，调节接收物镜的位置，使接收物镜的中心与45°微棱镜的反射面相对 应，样品架设置在压电扫描系统的压电平移台上，压电平移台所在平面为x‑y平面，垂直于 压电平移台的方向为z方向，微管的长边方向为y方向，短边方向为x方向，具体调节方法如 下： [0033] i.样品架位于压电扫描系统的压电平移台上，观测微管的位置，通过压电平移台 移动微管的位置，使得微管大致位于激发物镜的中心，在微管中放置荧光微球，打开白光照 明系统，调节样品架的z方向，在相机中观察到样品架，调节样品架的x方向位置，直至在第 二相机中观察到微管中的样品处于在焦状态，继续调节样品架的x方向位置，能够观察到 45°微棱镜、样品和微管的管壁，并在保持y方向不动的前提下，将样品架移动到 [0034] 样品位于前焦平面的位置； [0035] ii.45°微棱镜和微管的管壁之间的距离在0.1mm～0.5mm，在调节探测物镜时，只 小范围微调接收物镜的x方向距离，经过45°微棱镜反射的光的光程大于微管直接透射光的 光程，在实际调节时，通过确定45°微棱镜的反射面为焦平面，横向移动探测物镜，不再进行 探测物镜轴向位置调节时，均不存在焦图像，且能够在视野中观察到微管的管壁的信息来 判断第一相机的探测平面是否为45°微棱镜反射的样品的轴平面信息。 [0036] 在步骤7)中，调节第一相机的接收平面与入光方向垂直，同时保证入光点位于接 收平面的正中间位置。 [0037] 在步骤9)中，控制装置为数字采集系统DAQ，通过输出模拟信号控制数字扫描装置 的扫描范围和采样频率；通过输出数字信号触发控制第一相机逐行曝光、曝光每行之间的 间隔和触发延时；模拟信号和数字信号同步输出，通过设置每个平面的曝光时间、步进距离 9 9 CN 113552709 B 说明书 5/8页 和扫描范围，保证数字扫描装置的每一个扫描位置与第一相机曝光行相匹配，以保证高分 辨成像。 [0038] 本发明的优点： [0039] 本发明利用45°微棱镜，将通常物镜复杂倾斜放置的光片系统简化为透射式显微 成像系统，光路调节简单，能够与多种成像模态相结合；且样品只需注射入微管，或使细胞 等生物样品在微管中生长即可，无需对样品进行复杂的处理；且一次即可激发完整的轴平 面，能够快速实现轴向特殊分布样品的观测，且装置能够实现对大数值孔径物镜的使用，从 而改善传统光片荧光显微成像中分辨率无法进一步提升的限制；并且，光路设计简单易行， 便于实现后续产业化发展。 附图说明 [0040] 图1为本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置的实施例一的光 路图； [0041] 图2为本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置的实施例一的样 品架的俯视图； [0042] 图3为本发明的激发物镜、微管、45°微棱镜和探测物镜的实施例一的光线为本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置的实施例一的实 验结果图； [0044] 图5为本发明的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置的实施例二的微 管与45°微棱镜的位置关系示意图。 具体实施方式 [0045] 下面结合附图，通过具体实施例，进一步阐述本发明。 [0046] 实施例一 [0047] 如图1所示，本实施例的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置包括：激 光光源1、高斯光扩束准直装置2、空间光场调控装置3、聚焦透镜4、第一反射镜5、数字扫描 装置6、4f中继系统、第一分束镜9、第一管镜19、滤波片20、第一相机21、第二反射镜12、第二 分束镜13、LED白光光源14、激发物镜15、压电扫描系统16、接收物镜17、反射镜18、第二管镜 10、第二相机11和控制装置；其中，如图2所示，样品架包括平板22、通光孔、微棱镜固定装置 23、微管固定装置24、45°微棱镜25和微管26，平板的中间开设有贯穿平板上下表面的通光 孔，在平板的上表面且位于通光孔的上方设置有微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两 侧分别设置有微管固定装置，通光孔的底部为竖直(沿z轴)放置的激发物镜，微管的横截面 为方形，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于通光孔的顶部，45°微棱镜 通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边面为反射面，45°微棱镜的 第一直角边面位于x‑y平面，平行于平板的上表面且与微管的下表面平齐，第二直角边面垂 直于平板的上表面，微管的横截面为矩形，45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的一个 侧壁底边贴合紧靠微管，在45°微棱镜的反射面上方为竖直(沿z轴)放置的接收物镜，样品 位于微管内；样品位于激发物镜15的前焦平面处，样品架放置在压电扫描系统16上；接收物 10 10 CN 113552709 B 说明书 6/8页 镜17放置在平移台上，压电扫描系统16、数字扫描装置6和第一相机21连接至控制装置；激 光光源1发射出线偏振高斯光束，出射光光轴沿x方向；线偏振高斯光束经高斯光扩束准直 装置2后，进入空间光场调控装置3；空间光场调控装置3产生无衍射光束，并且对产生的无 衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束的空间分布特性进行改变；经聚焦透镜4聚焦后， 无衍射光束经第一反射镜5反射进入数字扫描装置6，通过扫描无衍射光束产生均匀的光 片，后由4f中继系统将数字扫描装置6上的光场分布中继到竖直放置的激发物镜15后焦平 面作为激发光，进入激发物镜15入瞳，为使光轴沿x方向的光束进入竖直放置的物镜需经第 二反射镜12反射，反射后光轴沿z方向；聚焦透镜4、4f中继系统和激发物镜15满足共焦条 件，构成共焦系统，4f中继系统包括两个焦距相同的第一透镜7和第二透镜8，无衍射光束通 过聚焦透镜4和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜15聚焦平面处的聚焦光斑为轴向线 光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发物镜 15聚焦，激发物镜15的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激发物 镜15的后焦平面处的频谱分布由激发物镜15的傅里叶变换作用，在激发物镜15的前焦平面 产生无衍射光束的y‑z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向并垂 直于样品表面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光；荧光入射到45°微棱镜的反 射面后反射成x‑y平面，直接由竖直放置的接收物镜17收集；经第三反射镜18反射后，经第 一管镜19会聚以及滤波片20滤波后成像到第一相机21上；第一相机21直接接收样品的二维 图像；同时LED白光光源14经第二分束镜13反射后照射样品，由激发物镜15收集后，经第二 反射镜12反射以及第一分束镜9反射后，由第二管镜10成像到第二相机11上，观察样品的x‑ y平面信息，并确定微管中的样品处于激发物镜15的前焦平面，即处于贝塞尔光束区；确定 微管中样品位于激发物镜15的焦平面；控制装置控制数字扫描装置6和第一相机21同步；压 电扫描系统16对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移动扫描，获得整 个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。 [0048] 高斯光扩束准直装置2包括焦距不同的两个透镜，其中，焦距不同的两个透镜对激 光器出射的线偏振高斯光束的准直状态和光斑直径进行调制，从而出射准直光，且光斑的 直径与空间光调制器的液晶面板相适配。 [0049] 空间光场调控装置3包括二分之一波片3‑1、96°棱镜3‑2和空间光调制器3‑3；其 中，二分之一波片对扩束准直后的线偏振高斯光束进行偏振态调制，使其与空间光调制器 的硅基液晶晶体偏振方向相适配；96°棱镜对光路进行折叠，偏振态呈水平偏振的线°反射棱镜反射后投射到空间光调制器的硅基液晶面板上，通过空间光调制器上加载 不同的相位全息图，产生贝塞尔(Bessel)光束，调制后的光场再次被96°反射棱镜反射至光 路中，入射角与反射角之间的夹角为6°，使得达到空间光调制器最高的调制效率。 [0050] 在本实施例中，激光光源1为561纳米连续光半导体激光器，线偏振高斯光经过扩 束准直系统2后，扩束到直径约12毫米；空间光调制器3‑4采用纯相位型硅基液晶空间光调 制器；空间光调制器与聚焦透镜4之间的距离为100毫米；光束扫描系统中振镜5扫描幅度为 电压每增加或减少1V，最大扫描角度增加或减少1°；依据4f中继系统6与激发物镜158的共 焦关系，为了获得100微米的光片宽度，选择施加到振镜上的电压范围是－4.5V到4.5V，扫 描振镜响应频率为10000赫兹。 [0051] 如图2所示，微棱镜固定装置用于放置固定45°微棱镜，并与微管紧靠，其中间开设 11 11 CN 113552709 B 说明书 7/8页 有用来固定45°微棱镜的微棱镜开孔，形状为正方形，尺寸为1mm×1mm，45°微棱镜一面与正 方形孔的背面紧靠；微棱镜固定装置的左右两端螺丝孔的型号为M1，用于将微棱镜固定装 置与样品架主体紧密安装；微管固定装置的中间开设有用于固定微管的微管开孔，形状为 方形，大小为0.85mm×0.85mm，微镜的切面为0.8mm×0.8mm从中穿过；微管固定装置左右两 端螺丝孔的型号为M1，用于与样品架主体紧密安装。微管固定装置上方的螺丝孔的型号为 M2，用于固定微管，使其不会移动。 [0052] 本实施例的基于45°微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像方法，包括以下步骤： [0053] 1)装置安装： [0054] a)将平板的中间开设贯穿平板上下表面的通光孔，在平板的上表面且位于通光孔 的上方设置微棱镜固定装置，在微棱镜固定装置的两侧分别设置微管固定装置，通光孔的 底部设置竖直放置的激发物镜15，微管通过微管固定装置水平安装在平板的上表面且位于 通光孔的顶部，45°微棱镜通过微棱镜固定装置安装在平板的上表面，45°微棱镜的斜角边 面为反射面，45°微棱镜的第一直角边面位于x‑y平面，平行于平板的上表面且与微管的下 表面平齐，第二直角边面垂直于平板的上表面，微管的横截面为矩形，45°微棱镜的第一直 角边面的底边与微管的一个侧壁底边贴合紧靠微管，在45°微棱镜的反射面上方为竖直(沿 z轴)放置的接收物镜17，接收物镜17放置在平移台上，完成样品架设置； [0055] b)样品位于微管内，样品位于激发物镜15的前焦平面处，样品架放置在压电扫描 系统16上； [0056] c)接收物镜17放置在平移台上，压电扫描系统16、平移台、数字扫描装置6和第一 相机21连接至控制装置； [0057] 2)激光光源1发射出线偏振高斯光束，光轴沿z方向； [0058] 3)线偏振高斯光束经高斯光扩束准直装置2后，进入空间光场调控装置3；空间光 场调控装置3产生无衍射光束，并且对产生的无衍射光束进行相差矫正以及对无衍射光束 的空间分布特性进行改变； [0059] 4)经过聚焦透镜4，无衍射光束聚焦至数字扫描装置6，并因聚焦透镜4的傅里叶变 换作用在数字扫描装置6处产生无衍射光束的频谱分布，通过扫描无衍射光束产生均匀的 光片，后由4f中继系统将数字扫描装置6上的频谱分布中继到竖直放置的激发物镜15后焦 平面作为激发光，进入激发物镜15入瞳，光轴沿z方向； [0060] 5)聚焦透镜4、4f中继系统和激发物镜15满足共焦条件，构成共焦系统，无衍射光 束通过聚焦透镜4和4f中继系统的共焦传递后，到激发物镜15聚焦平面处的聚焦光斑为轴 向线光，由光束扫描系统，使轴向线光变为轴向面光形成数字激发光片，由竖直放置的激发 物镜15聚焦，激发物镜15的后焦平面与前焦平面的广场分布为傅里叶变换共轭关系，将激 发物镜15的后焦平面处的频谱分布由激发物镜15的傅里叶变换作用，在激发物镜15的前焦 平面产生无衍射光束的y‑z平面的光片，形成虚拟的数字激发光片，数字激发光片沿着轴向 并垂直于样品表面，对位于微管内的样品进行片状激发，产生荧光； [0061] 6)荧光入射到45°微棱镜的反射面后反射成x‑y平面，直接由竖直放置的接收物镜 17 [0062] 收集； [0063] 7)经第一管镜19会聚成像到第一相机21上； 12 12 CN 113552709 B 说明书 8/8页 [0064] 8)第一相机21直接接收样品的二维图像； [0065] 9)同时LED白光光源14照射样品，由激发物镜15收集后，经第二管镜10成像到第二 相机11上，观察样品的x‑y平面信息，并确定微管中的样品处于激发物镜15的前焦 [0066] 平面，即处于贝塞尔光束区； [0067] 10)控制装置控制数字扫描装置6和第一相机21同步； [0068] 11)压电扫描系统16对样品进行沿垂直于轴向及数字激发光片的方向进行一维移 动扫描，获得整个三维荧光分布，从而得到样品的三维分布。 [0069] 图3所示为本实施例的样品架附件光线产生的扫描光片 对位于微管26中的样品进行激发，该激发平面经45°微棱镜25反射后被接收物镜17接收。 [0070] 图4为本实施例的基于微棱镜的反射式轴向光片荧光显微成像装置对直径10微米 的荧光小球样品的实验成像结果，其中标尺长度为10微米。 [0071] 实施例二 [0072] 在本实施例中，微管的截面为圆形，45°微棱镜的第一直角边面的底边与微管的侧 壁最外侧切面在同一平面，如图5所示。 [0073] 最后需要注意的是，公布实施例的目的是帮助进一步理解本发明，但是本领域 的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附的权利要求的精神和范围内，各种替换和修 改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内容，本发明要求保护的范围以权 利要求书界定的范围为准。 13 13 CN 113552709 B 说明书附图 1/3页 图1 图2 14 14 CN 113552709 B 说明书附图 2/3页 图3 图4 15 15 CN 113552709 B 说明书附图 3/3页 图5 16 16
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